첫번째 스트랜드 cdna 합성은 R1011/R1012 역전사 효소 PCR 시약을 장비를 답니다

RT - PCR 장비

단지 연구 용도를 위해

어떤 Cat. R1011, 20 르크스스

어떤 Cat. R1012, 100 르크스스

장비의 성분

저장

장비의 모든 성분은 -20' Ｃ에 저장되어야 합니다. 더 긴 저장을 위해 RNA 통제를 -70' Ｃ에 두세요.

기술

RT-PCR 장비는 정제된 poly(A)+ 또는 전 rna로부터 첫번째 가닥 cdna를 합성하기 위해 최적화됩니다. RT-PCR를 위한 RT-PCR 장비는 편리한 포맷에서 상승된 상보DNA 수익률과 고감도와 전-길이 트랜스크립트를 전달합니다. 당신은 시간을 절약하고 모든 실험과 성공을 보장하면서, 성공적 첫 번째 가닥 cdna 합성을 위해 필요로 하는 모든 성분을 얻습니다. 장비 역전사 효소는 RN아제 H 활동을 감소시키기 위해 설계된 M-MLV RT에 대한 버전을 있고 증가된 열 안정성을 제공합니다. 효소는 증가된 구체화와 상보DNA의 더 높은 수익률과 다른 역전사 효소 보다 더 많은 전-길이 제품을 제공하면서, 42-55' Ｃ의 온도 범위에 상보DNA를 합성하는데 사용됩니다.

애플리케이션

RT-PCR를 위한 첫번째 스트랜드 cdna 합성

cdna 라이브러리의 구조

단단계 RT-PCR

시발체 연장

중요한 노트

리보뉴클레아제 오염물을 회피하기

RNA 순도와 완전성은 전-길이 cdna을 종합에 필수적입니다. RNA는 어떠한 실험실 환경에서도 발견된 대단히 안정적 불순물인 RN아제 A에 의해 떨어뜨려질 수 있습니다. 장비의 모든 성분은 그들이 있다는 것을 보증하기 위해 엄하게 시험되었습니다 rnase-프리. 실험실 환경과 시약 모두 오염물을 방지하기 위해, 모든 준비된 솔루션은 르나세스가 없습니다. RNA 가수분해효소 오염물을 피하기 위한 일반적 권고 :

• 모든 튜브와 피펫이 cdna 합성 또는 사용 공인된 무뉴클레아제 랩웨어에서 사용되기 위해 비밀 정보를 제공하는 DEPC-대접.
• 외피가 르나세스을 얻는 공통 소스인 것처럼, RNA와 모든 시약을 취급할 때 장갑을 착용하세요. 자주 변화 글러브.
• 고급 품질 물 (예를 들면, depc 처리 용수)를 포함하여 rnase-프리 시약을 사용하세요.
• 르나세스의 행위에게서 RNA를 보호하기 위해 동셍 리보핵산분해효소 억제제 (#R2011)와 같은 rnase 저해제를 사용하세요.
• 팽팽하게 사용하지 않을때 밀봉된 모든 키트 부속을 유지하세요. 팽팽하게 역전사 반응 동안 마무리된 모든 튜브를 유지하세요.

주형 rna

표준 방법으로 격리된 전체 세포 rna는 장비에 대한 용도로 적당합니다. 푸리피에드 RNA는 cdna 합성 반응을 억제하기를 회피하도록 소금, 금속 이온, 에탄올과 페놀이 없슴에 틀림없습니다. 추적 오염균은 추운 75% 에탄올과 환약의 2번 세정이 이어진 RNA의 에탄올 침전에 의해 제거될 수 있습니다. RT-PCR 앱을 위해, 주형 rna는 DNA 오염물이 없습니다. cdna 합성에 이전이게, RNA는 DNA의 추종량을 제거하기 위해 DN 분해 효소 I로 치료될 수 있습니다. DN 분해 효소 내가 사용자에 의해 획득되어야만 합니다. 반대의 전사효소 효소를 제외하고 RT-PCR를 위한 모든 성분을 포함하는 제어 (RT-마이너스) 반응을 항상 수행하세요.

RN아제 H 소화

PCR 단계의 민감도는 RNA 템플릿을 상보DNA에서 제거함으로써 (특히 긴 템플릿을 위해) 증가될 수 있습니다 :첫 가닥 합성 뒤에 있는 RN아제 H 에 의한 소화에의해서 RNA 혼성 분자. 첫 가닥 합성 동안 RN아제 H 이 존재는 위축된 전체 길이 cdna 합성과 첫번째 가닥 cdna의 감소한 수율의 결과를 초래한 템플릿 ｍＲＮＡ를 떨어뜨릴 것입니다.

프라이머

첫번째 가닥 cdna을 종합은 또한 oligo(dT)15 프라이머, 랜덤 프라이머 또는 유전자 특이성 프라이머를 미리 제공받을 수 있습니다.

폴리(A)로부터의 Oligo(dT)15 프라임 cdna 합성은 진핵 mrna의 3 '-마지막에 참석하여서 첨부됩니다. 랜덤 프라이머는 전 rna 인구 (르르나와 ｍＲＮＡ)로부터의 cdna 합성을 착수합니다. 그러므로, 첫번째 가닥 합성을 위해 랜덤 프라이머를 사용하는 것 oligo(dT)15 프라이머와 비교해서 생성된 상보DNA의 더 큰 복잡성의 결과가 됩니다. 결과적으로, 차후 PCR 반응의 민감도와 전문성은 감소될 수 있습니다. 그러나, 폴리(A) 열 없이 마르나스를 사용하는 cdna 합성 또는 poly(A)-enriched rna 샘플을 사용하는 cdna 합성과 같은 그것이 랜덤 프라이머를 사용하도록 유익한 여러 애플리케이션이 있습니다.

유전자 특이성 프라이머는 전 rna 또는 ｍＲＮＡ의 기업 연합으로부터 특정한 cDNA를 합성하는데 사용되고, 사용자에 의해 획득되어야만 합니다.

처음으로 - 가닥 cdna 합성 절차

첫번째 - 가닥 cdna 반응은 개별적 반응으로서 또는 다른 RNA 템플릿과 일련의 평행 반응으로서 수행될 수 있습니다. 그러므로, 반응 혼합물은 개별적으로 결합하는 시약에 의해 준비될 수 있거나 주형 rna를 제외하고 모든 성분을 포함하는 마스터 믹스가 준비될 수 있습니다. RNA 템플릿의 구조에 따라서, RNA 변성과 프라이머 어닐링을 위한 각각의 단계는 RT-PCR 결과를 향상시킬 수 있습니다.

프로토콜

나. 첫번째 스트랜드 cdna 합성

1. 다음과 같은 시약을 지정된 순서에서 얼음에서의 불모 무뉴클레아제 튜브에 부가하세요 :

2. 점잖게 혼합되고, 간략하게 원심기로 분리하고 5 분 동안 70' Ｃ에 잠복하세요. 얼음에서 냉각되고, 아래 회전하고 뒤로 물약병을 얼음에 두세요.

3. 다음과 같은 cdna 합성 혼합으로 준비하, 지정된 순서의 다음과 같은 부품이 덧붙입니다 :

4. 점잖게 혼합되고 간략하게 원심기로 분리하세요.

5. oligo(dT)15를 위해 42' Ｃ에 60 분 동안 잠복하세요. 무작위 헥사머 주된 합성을 위해 37' Ｃ에 60 분 동안 잠복하세요.

6. 5 분 동안 70' Ｃ로 가열함으로써 반응을 끝내세요.

역전사 반응 생성물은 두번째 가닥 cdna 합성 반응에서 바로 사용되거나 주 이하을 위해 -20' Ｃ에 저장될 수 있습니다. 더 긴 저장을 위해, -70' Ｃ는 권고됩니다.

II. 첫번째 가닥 cdna의 PCR 증폭

첫번째 스트랜드 cdna 합성의 제품은 PCR 또는 큐피크레에서 직접적으로 사용될 수 있습니다. 첫번째 스트랜드 cdna 합성 반응 혼합물의 크기는 전체 PCR 반응 부피의 1/10 이상을 포함하여서는 안됩니다. 정상적으로, 첫번째 스트랜드 cdna 합성 반응 혼합물 중 2 μl은 50 μl 전체 양에서 차후 PCR를 위한 템플릿으로서 사용됩니다.